П. Ф. Забродский, М. С. Громов, И. Х. Яфарова влияние хронической интоксикации ацетонитрилом на показатели системы иммунитета и соде - shikardos.ru o_O
Главная
Поиск по ключевым словам:
страница 1
Похожие работы
П. Ф. Забродский, М. С. Громов, И. Х. Яфарова влияние хронической интоксикации ацетонитрилом - страница №1/1

П.Ф. Забродский, М. С. Громов, И.Х. Яфарова

ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ АЦЕТОНИТРИЛОМ НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА И СОДЕРЖАНИЕ ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫХ, ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В КРОВИ

Саратовский филиал Самарского медицинского института «РЕАВИЗ»


В экспериментах на неинбредных белых крысах установлено, что после хронического действия ацетонитрила (30 сут, ежедневно подкожно 0,05 DL50) в равной степени снижаются иммунные реакции, связанные с функцией Th1-, Th2- и В-лимфоцитов, уменьшается активность естественных клеток-киллеров, антителозависимая клеточная цитотоксичность, содержание в крови иммунорегуляторных, провоспалительных и антивоспалительных цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-13).

__________________________________________________________________

Ключевые слова: ацетонитрил, Тh1-, Th2-лимфоциты, иммунотоксичность, цитокины.

Введение. Ацетонитрил (АН, нитрил уксусной кислоты, метилцианид, цианметан) – летучая, бесцветная, горючая жидкость с запахом эфира. АН широко используется в химической промышленности в органическом синтезе, производстве ароматических веществ, фармацевтических и парфюмерных препаратов, как селективный растворитель углеводородов, масел [3,11]. АН является одним из самых распространенных лигандов в координационной химии [9]. Высокочистый ацетонитрил широко используется в высокоэффективной жидкостной хроматографии, газовой хроматографии и масс-спектрометрии, как элюент [10].

В связи с возможной хронической интоксикации АН в процессе его получения и работы с ним, при авариях на химических объектах и загрязнением местности могут формировать вторичные иммунодефицитные состояния [2,3]. При этом изучение нарушений параметров системы иммунитета, в частности, продукции цитокинов лимфоцитами и другими клетками крови представляет как теоретический, так и практический интерес для профилактики и лечения, возникающих в период и после хронического отравления АН различных инфекционных осложнений и заболеваний [1,4]. Влияние хронической интоксикации АН на систему иммунитета не изучено [1,2,3,4].

Целью исследования являлась оценка хронического действия АН течение 30 сут на иммунные реакции, а также на содержание в крови иммунорегуляторных, провоспалительных и антивоспалительных цитокинов цитокинов (γ- интерферона - ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10 и ИЛ-13).

Материал и методы исследования. Опыты проводили на беспородных белых крысах обоего пола массой 180-240 г. АН вводили подкожно ежедневно в течение 30 сут в дозе 0,05 DL50 (суммарная доза 1,5 DL50). DL50 АН для крыс при подкожном введении составляло 1750+95 мг/кг. Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии и иммунологии [3,5] после хронической интоксикации АН через 30 сут после первой инъекции токсиканта. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (эритроцитам барана - ЭБ), характеризующую способность Th1-лимфоцитов участвовать в продукции плазматическими клетками IgM, определяли по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке через 4 сут после иммунизации (пик продукции IgM), которую проводили внутрибрюшинно в дозе 2·108 на 26 сут после первого введения АН. Аналогично оценивали гуморальную иммунную реакцию к тимуснезависимому брюшнотифозному Vi-антигену (Vi-Ag), отражающую синтез IgM B-клетками (плазмоцитами) селезенки крыс. При этом проводили иммунизацию крыс Vi-Ag в дозе 8 мкг/кг. Функцию Th1-лимфоцитов оценивали также по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Формирование ГЗТ, исследовали у животных по приросту массы стопы задней лапы в %. Разрешающую дозу ЭБ (5·108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 сут после иммунизации, которую проводили внутрибрюшинно на 26 сут после первого введения АН. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 ч. Функцию Th2-лимфоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующие IgG к ЭБ, в селезенке на пике продукции данного иммуноглобулина (на 14 сут после иммунизации) методом непрямого локального гемолиза в геле [5]. При этом крыс иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2·108 клеток на 16 сут после первого введения АН.

Оценку активности естественных клеток–киллеров (ЕКК) и антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ), характеризующую функцию К-клеток, осуществляли спектрофотометрическим методом через 30 сут после первого введения АН [3]. При этом иммунизацию ЭБ (108 клеток) проводили за 4 сут до последнего введения АН (на 26 сут).

Концентрацию цитокинов иммунорегуляторных цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4), провоспалительного цитокина (ИЛ-6) и антивоспалительных цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-13) [8] исследовали в плазме крови крыс через 30 сут после первой инъекции АН методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. При этом ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 определяли через 4 сут после иммунизации ЭБ, а ИЛ-4 - на 14 сут ( иммунизацию ЭБ проводили на 16 сут после первого введения АН).

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.



Результаты и обсуждение. После хронической интоксикации АН через 30 сут показатели Т-зависимого - АОК к ЭБ (IgM), АОК к ЭБ (IgG) - и Т-независимого гуморального иммунного ответа - АОК к Vi-Ag (IgM) – снижались соответственно в 1,38; 1,39 и 1,42 раза (p<0,05). Это свидетельствует о том, что АН при хроническом отравлении поражает Т-клетки и В-лимфоциты в равной степени.

Параметры клеточных иммунных реакций после воздействия АН в течение 30 сут - активность ЕКК, АЗКЦ, реакция ГЗТ - уменьшались соответственно в 1,40; 1,44 и 1,45 раза (p<0,05). Полученные данные позволяют считать, что гуморальное и клеточное звенья иммунитета при хроническом воздействии АН поражаются практически одинаково.



После интоксикации АН происходит в равной степени, как редукция функции Th1-клеток (АОК к ЭБ - IgM, реакция ГЗТ), так и Th2-лимфоцитов (АОК к ЭБ - IgG). Активность ЕКК и АЗКЦ в определенной степени зависит от функции Т-лимфоцитов (хелперов) первого типа (Th1). Снижение данных параметров, о чем свидетельствуют данные табл. 1, приблизительно такое же, как и реакция, зависящая от Th2-клеток, а также гуморальный иммунный ответ, характеризующий активность В-лимфоцитов (АОК к Vi-Ag - IgM).

Таблица 1

Влияние хронической интоксикации ацетонитрилом (суммарная доза 1,5 DL50, 30 сут) на показатели системы иммунитета белых крыс (М+m, n=9-11)





Показатели

Контроль

АН

АОК к ЭБ (IgM), 103

40,5+4,1

29,4+2,9*

АОК к ЭБ (IgG), 103

56,7+5,5

40,8+4,3*

АОК к Vi-Ag (IgM), 103

29,8+3,1

21,0+2,3*

Активность ЕКК, %

27,9+2,9

20,0+2,1*

АЗКЦ, %

12,8+1,3

8,9+1,0*

ГЗТ, %

35,9+3,7

24,7+3,0*

* -p<0,05 по сравнению с контролем.
Под влиянием АН после хронической интоксикации в течение 30 сут (табл. 2) происходило снижение содержания в крови ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4 (иммунорегуляторные цитокины), ИЛ-6 (провоспалительный цитокин), ИЛ-10 и ИЛ-13 (антивоспалительные цитокины) в равной степени. Так, ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ 13 уменьшались соответственно в 1,34; 1,33; 1,43; 1,51; 1,35 и 1,41 раза (р<0,05). Следует отметить, что ИЛ-4 и ИЛ-6 могут выполнять и антивоспалительные функции [8].

Таблица 2

Влияние хронической интоксикации ацетонитрилом (суммарная доза 1,5 DL50, 30 сут) на содержание цитокинов в крови белых крыс, пг/мл (М+m, n=8-10)


Цитокины

Контроль

АН

ИФН-γ

1016+85

760+80*

ИЛ-2

1245+110

933+94*

ИЛ-4

93+9

65+7*

ИФНγ/ИЛ-4

10,9+1,1

11,7+1,2

ИЛ-6

127±13

84±10

ИЛ-10

983±87

730±75*

ИЛ 13

110+12

78+8*

*-p<0,05 по сравнению с контролем.
После хронической отравления АН установлено уменьшение концентрации ИФН-γ на 5 сут после иммунизации ЭБ в 1,34 раза (p<0,05), а ИЛ-4 на 14 сут после иммунизации ЭБ - в 1,43 раза (p<0,05). При этом соотношение ИФНγ/ИЛ-4 в контроле составляло 10,9+1,1, а после действия АН - 11,7+1,2. Это свидетельствует о том, что концентрации ИФН-γ и ИЛ-4 в крови под влиянием АН снижаются в равной степени, следовательно функция Th1- и Th2- лимфоцитов поражается одинаково [3,6].

Полученные данные позволяют полагать, что одинаковое снижение активности Th1- и Th2- лимфоцитов в равной степени может приводить к развитию, как микробной (основная защитная роль выполняется Th2-лимфоцитами и связанными с ними плазмоцитами, синтезирующими иммуноглобулины класса G за иcключением IgM и IgG2a, продукция которых осуществляется при помощи Th1-лимфоцитов), так и вирусной инфекции (основная защитная роль наряду с другими Т-клетками, ЕКК и К-клетками принадлежит Th1-лимфоцитам) [3,5,7].

Уменьшение содержания в крови ИФН-γ (иммунорегуляторный цитокин) связано с поражением АН в основном Th1-лимфоцитов, а также ЕКК, К-клеток, осуществляющих АЗКЦ, цитотоксических Т-лимфоцитов [12]. Снижение в плазме крови после хронической интоксикации АН ИЛ-2 (иммунорегуляторного цитокина) свидетельствует о супрессии его продукции Т-клетками, в том числе и лимфоцитами Th0- и Th1-типа), снижении пролиферации Т- и В-клеток, активности ЕКК и АЗКЦ. Уменьшение в крови ИЛ-6 (провоспалительного интерлейкина и в определенных случаях антивоспалительного цитокина) характеризует редукцию его синтеза макрофагами и лимфоидными дендритными клетками вследствие их поражения АН и продуктами его метаболизма. Снижение в крови ИЛ-4 (иммунорегуляторного и в определенных случаях антивоспалительного цитокина) [8] обусловлено поражением АН преимущественно Th1- лимфоцитов [3,5,8].

Супрессия синтеза ИЛ-10 (антивоспалительного цитокина) под влиянием АН связана с поражением токсикантом Th0-, Th2-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и В-клеток [3,5]. Уменьшение содержания в крови ИЛ-10 в такой же степени, как и ИФН-γ, подтверждает установленный нами равный поражающий эффект АН в отношении Th1- и Th2- лимфоцитов.

Снижение ИЛ-13 (антивоспалительного цитокина) обусловлено поражением АН в основном Th2-лимфоцитов, а также и других клеток крови. При этом может нарушаться модуляция данным цитокином аллергических реакций, а также апоптоза или роста опухолевых клеток [13].

АН метаболизируется, в основном, образуя цианид, за счет которого проявляется его иммунотоксическое действие вследствие ингибирования в клетках иммунной системы компонента тканевого дыхания а3 цитохром-с-оксидазы, а также более 40 железо-, медь-, цинксодержащих ферментов. Кроме того, в процессе биотрансформации АН образуются роданиды, муравьиная кислота и аммиак, которые, за исключением роданидов, обладают выраженным иммунотоксическим действием [3].

Таким образом, хроническое действие АН (30 сут, суммарная доза 1,5 DL50) в равной степени снижает Т-зависимый и Т-независимый гуморальный иммунный ответ, показатели клеточного звена иммунитета, функцию Th1- и Th2-лимфоцитов, содержание в крови иммунорегуляторных, провоспалительных и антивоспалительных цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13).

Выводы.

1. Хроническая интоксикация ацетонитрилом в течение 30 сут в суммарной в дозе, составляющей 1,5 DL50, в равной степени уменьшает активность Th1- и Th2-лимфоцитов, гуморальные и клеточные иммунные реакции.

2. После хронического отравления ацетонитрилом в равной степени снижается концентрация в крови иммунорегуляторных, провоспалительных и антивоспалительных цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


  1. Забродский П.Ф. // Эксперим. и клин. фармакол. 1999.Т. 62. №3. С. 48-49.

  2. Забродский П.Ф., Германчук В.Г. // Токсикол. вестник. 2000. №5. C. 12-15.

  3. Забродский П.Ф., Мандыч В.Г. Иммунотоксикология ксенобиотиков. Саратов, СВИБХБ, 2007. 420 с.

  4. Общая токсикология / Под ред. Б.А. Курляндского, В.А. Филова. М.: Медицина, 2002. 608 с.

  5. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. М.: Мир, 2000. 582 с.

  6. Сухих Г.Т., Касабулатов Н.М., Ванько Л.В. и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2005. Т. 140, № 12. С. 622-624.

  7. Asquith B., Zhang Y., Mosley A.J., de Lara C.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2007. Vol. 104, № 19. P. 8035-8040.

  8. Becker K.L., Nylen E.S., White J.C. et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004. Vol. 89. №4. P. 1512-1525.

  9. Bocian W., Sitkowski J., Bednarek E. et al. // J. Biomol. NMR. 2008. Vol. 40. №1. Р. 55-64.

  10. Ogawa S, Yoshimura E.// J. Chromatogr. B, Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2012. Vol. 909. P. 34-36.

  11. Patil V.S., Nandre K.P., Ghosh S. et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012. Vol. 22. № 23. P. 7011-7014.

  12. Schoenborn J.R., Wilson C.B. // Adv. Immunol. 2007. Vol. 96. P. 41–101.

  13. Wynn T.A.// Annu. Rev. Immunol. 2003. Vol. 21. P.425-456.

P.F. Zabrodskii, M.S. Gromov, I.H. Yafarova

The effect of chronic intoxication with acetonitrile on parameters of immunity and content proinflammatory and antiinflammatory cytokines in blood

Saratov Branch of Samara Medical Institute «REAVIZ»



It was established in experiments on noninbred rats that chronic intoxication of acetonitrile (30 days, daily subcutaneous 0,05 LD50) equally reduces immune responses associated with the function of Th1-, Th2-and B-lymphocytes, decreases of activity of natural killers, antibody-depend cell-mediated cytotoxicity and reduces blood levels of immunoregulatory, proinflammatory and anti-inflammatory cytokines IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and IL-13.

Keywords: acetonitrile, Тh1-, Th2-lymphosytes, immunotoxity, cytokines.